贺福长, 李德伦, 毛天球
摘要
采用噻唑兰 (MTT) 方法观察 0.25T 的恒定强磁场对 4 种口腔颌面部癌细胞体外培养的影响. 发现磁场对这 4 种癌细胞均有不同程度的抑制作用, 其中腺癌细胞比鳞癌细胞对磁场更为敏感, 并且随着磁场作用时间加长, 这种抑制作用更明显. 平阳霉素对体外培养的人粘液表皮样癌 MEC-1系细胞生长有较强的抑制作用, 而与 0.25T 恒定强磁场联合应用后, 抑制作用明显增强, 两者有相加用.
关键词: 磁场; 癌; 平阳霉素
我们观察了 0.25T 恒定强磁场以及其联合平阳霉素对人口腔颌面部 4 种癌细胞体外培养的影响, 报道如下.
材料和方法
癌细胞系采用第四军医大学口腔医学院中心实验室建立的传代细胞系即人粘液表皮样癌 MEC-1系, 腺样囊性癌 SACC-83 系, 舌癌 Tca8113 系, 牙齦癌 Ca9-22 系; 平阳霉素为天津市河北制药总厂出品; 磁场由 N, S 极相对的上下两极组成, 每极又由 12 块钕铁硼永磁铁组成, 并经由特殊工艺加工成一整 体, 其面积比 96 孔培养板略大, 磁场强度均为 0.25T. 将上述 4 种细胞分别制备成适当浓度的细胞悬液, 以每孔 100µl (含细胞数为 103 个) 分别接种于 2 块 96 孔培养板, 每种细胞需接种 18 个培养孔, 于 37℃, 5% CO2 恒温孵箱中培养 24 小时, 使细胞贴壁生长后, 其中一块培养板不加磁场继续在上述条件下培养, 作为对照组. 另一块放人如上所述双极磁场内, 作为磁场处理组, 再将其放入 CO2 孵 中继续培养. 两组除所加磁场条件不同外, 其余细胞培养条件相同. 在对照组和磁场组细胞分别培养 5 天后, 每孔加入 10µl 噻唑兰 (MTT) 溶液, 继续培养 4 小时, 然后吸尽孔内液体, 每孔加入 150µl 二甲 基亚砜, 振荡 5 ̴10 分钟后, 在微孔比色仪上测定其吸收值 (A 值), 波长 490nm, 计算了 𝑥±𝑠 及抑制率 (%). 按上述同一方法同时观察 MEC-1 细胞作用 7天后结果. 在细胞体外培养过程中, 每天用倒置显微镜观察细胞体外生长情况. 另外将处于对数生长期的粘液表皮样癌细胞制备成适当密度的细胞悬液, 以每孔 100µl, 分别接种于两块 96 孔培养板. 培养 24 小时后, 把平阳霉素 (PYM) 按一定浓度梯度分别加入上述两块培养板中, 使 PYM 的最终浓度为 101, 102, 103, 104, 155ng/ml. 每一浓度组均作 4 个复孔, 并设对照孔(加同量的培养液). 其中一块培养板加 0.25T 磁场, 另一块不加磁场作为对照. 培养 5 天后, 每孔加入 MTT 20µl, 继续培养 4小时, 其余步骤同上, 根据测得的 A 值, 计算 𝑥±𝑠, 细胞抑制率及半抑制浓度等.
结果
4 种癌细胞在 0.25T 磁场作用下培养至 5 天, 其中 MEC-1 细胞分别培养至 5 天, 7 天 (表1). 在磁场对 4 种癌细胞作用 5 天时, 均有不同程度的抑制作用, 抑制率分别为 33.3%, 18.4%, 17.5% 和 15.9%, 经统计学检验 P ˂ 0.01, 差异均有非常显著性. MEC-1 系细胞, 在作用 7 天时, 抑制率提高到 61.9%.
平阳霉素在加磁场与未加磁场情况下对 MEC-1 系细胞的杀伤作用从表 2 可见, 联合磁场的平阳霉素对 MEC-1 系细胞体外杀伤作用明显高于单纯平阳霉素. 半抑制浓度值 (IC50) 分别为 251ng/ml, 562ng/ml (P˂0.01). 杀伤作用为单纯平阳霉素的 2.2 倍.
细胞密度, 形态在细胞培养前 3 天, 磁场组与对照组未见明显差别. 第 4 天开始, 磁场组中 MEC-1系细胞密度明显少于对照组, 核分裂相少见, 死细胞增多. SACC-83 细胞磁场组的细胞密度与对照组比差别不大, 但死细胞明显增多, 细胞失去正常形态. Tca8113 系细胞在培养 5 天时, 磁场组和对照组镜下观察差别不大, 但加入 MTT 培养 4 小时后, 对照组 Tca8113 细胞形成结晶物多, 死细胞少. 而磁场组中 Tca8113 细胞形成结晶物少, 死细胞多. 磁场组中 Ca9-22 细胞死亡较对照组明显增多, 细胞失去正常形态.
讨论
恒定强磁场对癌细胞的抑制作用, 不完全决定于强度, 也取决于磁场作用的长短. Halper 等 (1) 研究了0.12T 恒定强磁场对体外培养 Hela 细胞作用 2 – 7 天后, 观察细胞生长情况, 结果表明细胞生长不受影响. 张小云等 (2) 研究了 0.4T 和 0.6T 两种强度磁场对 Hela 细胞作用 2 天后细胞生长情况. 发现存在着差异, 在 0.6T 磁场作用下, 细胞生长受抑制, 而 0.4T 下的抑制作用不明显. 同时发现, 在磁场作用下, 细胞由 S期进入 G2 期的时间延缓. 这与常汉英等 (3) 报道的脉冲磁场造成 S180肉瘤活细胞核分裂相数目减少相一致. 实验表明, 0.25T 恒定强磁场作用 5 天后, 对 4 种癌细胞均有不同程度抑制作用, 且抑制率有下定差异. 由此可见, 不同癌细胞对同一磁强和作用时间的敏感性不同, 其抑制作用程度也不同. 其中 MEC-1 系细胞对磁场最为敏感, 抑制率最高, 而显微镜下观察, MEC-1 系的死细胞较对照组多见, 且核分裂相少见. 这一结果可能为今后临床应用磁场辅助治疗 MEC-1 提供重要的实验依据. 另外, 如场强不变, 将磁场对 MEC-1 作用时间延长至 7 天, 抑制率明显提高. 可见磁场同其他辐射一样, 作用时间不同将产生不同的生物效应. 同时说明磁场生物效应具有阈值性和时间累积效应. 关于强磁场导致癌细胞生长缓慢, 文献报道 (2) 多认为是在磁场作用下 S 期细胞增多并阻断于 G2 期, 使 M 期细胞减少, 这与 DNA 合成降低有关. 总之强磁场抑制肿瘤生长是各种作用综合的结果.
平阳霉素是国内临床常用的抗癌药物, 对体外培养的 MEC-1 系细胞生长有较强的抑制作用, 在其联合 0.25T 恒定强磁场后, 其抑瘤作用明显增强, 且是单纯平阳霉素 2.2 倍. 说明两者体外抑瘤作用上有相加作用. 其机制可能是由于平阳霉素细胞毒作用的环节是破坏 DNA 合成 (4), 从而抑制细胞有丝分裂, 为 S 相特异性抗癌药物. 而磁场抑瘤机制同样是使 DNA 合成降低 (2) , 这样两者在抑制瘤作用上将产生相加作用. 此外, 磁场能影响生物膜的电场和离子流的活动, 改变生物膜特性, 可能导致细胞膜对平阳霉素等抗癌药物的通透性增加, 从而增强抗癌药物的细胞毒作用. 因此, 在临床上实施抗癌药物同时, 再于肿瘤部位施加一定磁场, 将会提高疗效. 本实验检测磁场及平阳霉素对细胞生物学效应的方法, 是采用 MTT 试验. 是通过比色测定细胞数量和活性的新的试验方法. 其敏感性同其他经典方法, 具有敏感, 简便, 快速, 重复性好等优点 (5, 6) .
参考文献
1. Halper MH, Greene AE. Effects of magnetic fields on growth of Hela cells in tissue culture. Nature, 1964, 202:717.
2. 张小云, 张晓那, 恒定强磁场对 Hela 细胞生长分裂的影响. 科学通报, 1989, 34:1901.
3. 常汉英, 李佳兰, 陈普云, 等. 磁场对鼠 S180 肉瘤影响的实验观察. 中华物理医学杂志, 1985, 7:169.
4. 蒋关裕, 王蓉生. 平阳母素对 Hela 细胞 DNA 的体外断裂作用. 中国药理学通报, 1987, 3:202.
5. Alley MC, Mayer LD, Mulay IL, et al. Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay. Cancer Res, 1988.48:589.
6. Wu JZ, Shitu ZQ, Chen GY, et al. Cytotoxic activity of FK-937 against human oral and breast cancer cells. Chin Med J, 1991, 104:834.
激光治疗肛裂及并发肛管皮下痰
周听民
本组 54 例, 男 23 例, 女 31 例, 年龄 20 – 41 岁, 病程 8 个月 – 5 年. 术前确诊为II 期肛裂. 采用上海产35W 同光路 CO2 激光手术器侧切, 患者取膝胸位, 常规消毒, 1% 利多卡因 15ml 加 III 号止痛剂 4ml 肛管局部浸润麻醉, 轻揉肛门并用 0.1% 新洁尔灭消毒肛管, 手指扩肛, 肛门松弛后, 在 3 点或9点 (多数取3点)位距肛缘 1.5cm 处用激光刀切一三角型放射状切口, 深达皮下, 用弯止血钳沿该切口向齿线作钝性分离达齿线上端, 再用激光刀将止血钳挑起的内括约机切断. 对肛裂溃疡边缘增厚, 变硬, 不整齐的肉芽组织及裂痔用激光汽化干净. 然后手指扩肛至 3横指, 术毕在 V型创面内敷以止血纤维及油纱条, 无菌敷料包扎固定. 术后应用抗生素 3 – 7 天, 每日换药 1 次, 每日 1: 5000高锰酸钾水坐浴 2 – 3 次, 术后 8 – 10 天痊愈. 创面愈合 3 – 5 个月后, 其中 8 例在 V 型创面上口与底部之间形成肛管皮下瘘. 肛管皮下痰的处理按低位肛瘘手术法, 常规消毒, 局麻后用银质探针从外口探至内口, 将探针头弯曲后拉出肛门, 用激光沿探针切开皮下瘘. 对切口内壁及周缘腐肉等肉芽组织用激光束烧灼汽化干净, 术后约一周痊愈.
肛裂采用激光治疗具有出血少, 损伤轻, 痛苦小, 不易感染等特点, 术后创面愈合较快. 但术后并发肛管皮下凄应引以为戒. 其原因: ① 肛管外创面愈合速度大于肛管内创面愈合速度, 手术时对其创面未修剪或修剪甚少, 未能形成底小外口大的斜坡状创面; ② 肛裂术后炎性渗出, 伤口水肿, 异物刺激, 引起肉芽组织过度增生, 并未及时修剪, 使伤口形成假愈合. 我们吸取上述经验教训, 术时对创面适当修剪, 术后早期采用紫草油纱条换药, 后期用高渗盐水纱条换药, 并局部抗感染, 使伤口内组织水肿及肉芽组织过度增生得到明显抑制, 并对个别增长过快的肉芽组织予以及时修剪, 伤口清洁引流通畅. 共作此激光术 31 例, 无一例并发肛管皮下瘘.
